Inseminazione degli ovociti

Gli ovociti, al recupero iniziale, sono dei complessi cumulo-ooforo-ovocita ovvero ovociti circondati da una rivestimento di cellule della granulosa. Per procedere alla tecnica di Fecondazione in Vitro, gli ovociti andranno decumulati, ovvero puliti dal rivestimento che li circonda per valutarne la maturità e quindi la possibile iniezione con lo spermatozoo selezionato. Subito dopo la decumulazione gli ovociti sono disposti in piastre di coltura preparate precedentemente con opportuni terreni di coltura. Le piastre, a loro volta, sono disposte all’interno di Incubatori che prevedono condizioni di temperatura e gas controllati.

Parallelamente, verrà preparato il Liquido seminale (fresco o crioconservato) per selezionale gli spermatozoi dotati di maggiore motilità e migliore morfologia.

Lo strumento utile per procedere alla ICSI (Iniezione Intracitoplasmatica dello Spermatozoo) è l’invertoscopio/micromanipolatore. Questo strumento, permette la manipolazione dei 2 gameti grazie ad aghi di dimensioni molto piccole (Holding - Injection) collegati a joystick guidati dall’embriologo.

I singoli ovociti vengono disposti in gocce di terreno di coltura tamponato (un terreno che garantisce il mantenimento del pH) in apposite piastre che permettono di eseguire la tecnica ICSI. Nella stessa piastra viene posizionata una goccia di PVP al 7% o al 10% (polivinilpirrolidone), un polimero idrosolubile, dove andranno inseriti gli spermatozoi. La funzione del PVP è di rallentare il movimento degli spermatozoi grazie alla sua consistenza molto viscosa. 

L’intera piastra, contenente entrambi i gameti, viene sommersa da un olio minerale per evitare l’evaporazione e la contaminazione delle gocce. 

Per procedere con la ICSI, l’ago Holding verrà utilizzato per aspirare e tenere bloccato l’ovocita , l’ago Injection servirà ad immobilizzare, aspirare e iniettare lo spermatozoo all’interno del citolplasma dell’ovocita.

Dopo la microiniezione gli ovociti verranno posti in mezzi di coltura opportuni per permettere lo sviluppo embrionale fino allo stato di Blastociti.

La Tecnica ICSI potrebbe essere sostituita, in alcuni casi, con la Tecnica FIVET.

La FIVET non prevede la microiniezione manuale dello spermatozoo nel citoplasma dell’ovocita ma l’interazione tra ovocita e spermatozoo avvengono in vitro (all’interno di piastre di coltura) seguendo i fisiologici eventi della fecondazione. 

In questo caso gli ovociti non andranno decumulati ma semplicemente messi a contatto con adeguate concentrazioni di spermatozoi precedentemente preparati. 

Il contatto tra i due gameti permette allo spermatozoo di attraversare le cellule del cumulo ooforo e della corona radiata dell’ovocita, interagire con con la zona pellucida del gamete femminile e consentire la fusione tra la membrana plasmatica dell’ovocita e il segmento equatoriale dello spematozoo.

Con entrambe le tecniche, il giorno seguente, si procede al controllo della fecondazione, evidenziando la presenza dei 2 pronuclei, formazioni all’interno dello zigote che confermano l’avvenuta fecondazione.

Se è stata eseguita la tecnica FIVET, prima di procedere con l’osservazione dei 2 pronuclei, bisognerà rimuovere le cellule ancora adese all’ovocita in modo meccanico con l’ausilio di un micro-capillare di circa 170 µm.