Oltre lo spermiogramma convenzionale
Lo spermiogramma rappresenta tradizionalmente il primo passo nella valutazione del fattore maschile d’infertilità, ma fornisce esclusivamente informazioni su parametri quantitativi e morfologici: concentrazione, motilità, morfologia secondo i criteri di Kruger. Non dice nulla, però, sull’assetto cromosomico degli spermatozoi né sull’integrità del DNA spermatico. È qui che entra in gioco la FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) spermatica, una tecnica di citogenetica molecolare che consente di analizzare direttamente il contenuto cromosomico dei gameti maschili, colmando una lacuna diagnostica fondamentale nell’inquadramento dell’infertilità di coppia.
I fattori maschili sono implicati in circa il 50% delle coppie in studio per infertilità, e le anomalie genetiche — inclusa l’aneuploidia spermatica — rappresentano una delle cause principali. L’ultima edizione del manuale WHO riconosce esplicitamente l’utilità crescente del FISH come strumento diagnostico citogenetico nella valutazione delle aberrazioni cromosomiche spermatiche.
Principio della tecnica
Protocollo in sintesi
Il protocollo, descritto in dettaglio da Sarrate et al. su JoVE, prevede diverse fasi:
- Raccolta del campione: dopo 2-3 giorni di astinenza, il campione seminale viene lasciato liquefare a temperatura ambiente (circa 20 minuti).
- Processamento e fissazione cellulare: il campione viene centrifugato, trattato con soluzione ipotonica (KCl 0,075M) e fissato con metanolo/acido acetico (fissativo di Carnoy).
- Decondensazione della cromatina: passaggio critico, poiché la cromatina spermatica è estremamente compattata. Si utilizza un agente riducente che rompe i ponti disolfuro, per rendere il DNA accessibile alle sonde.
- Denaturazione: incubazione in formamide a 73°C per separare i filamenti di DNA.
- Ibridazione: le sonde fluorescenti vengono applicate sugli spermatozoi fissati su vetrino e incubate in camera umida a 37°C per 6-24 ore.
- Visualizzazione al microscopio a fluorescenza: utilizzando filtri specifici si valuta il numero di segnali fluorescenti per ciascun cromosoma analizzato.
Cromosomi analizzati
Routinariamente si analizzano 5 cromosomi: X, Y, 13, 18 e 21 — quelli compatibili con nascita di prole vitale in caso di aneuploidia (sindromi di Klinefelter, Turner, Patau, Edwards, Down). L’analisi può essere estesa ad altri cromosomi in base al quadro clinico:
- Cromosomi 16 e 22 nei casi di aborti ricorrenti
- Cromosomi coinvolti in cariotipi anomali di gravidanze precedenti o del partner maschile
Criteri di scoring
Si raccomanda l’analisi di almeno 10.000-20.000 spermatozoi per paziente e per set di sonde. Uno spermatozoo normale mostra un singolo segnale per ciascun cromosoma analizzato. Gli spermatozoi con segnali aggiuntivi vengono classificati come disomici (due copie) o diploidi; quelli privi di segnale come nullisomici. Si contano solo cellule con margini ben definiti, non sovrapposte, e con segnali di intensità e dimensione omogenee.
Tassi di aneuploidia: normali vs. patologici
Negli uomini fertili normozoospermici, il tasso di aneuploidia spermatica si attesta generalmente sotto il 2%, con frequenze per singolo cromosoma comprese tra 0,03% e 0,47%. Gli uomini infertili mostrano tassi significativamente più elevati.
Lo studio retrospettivo più ampio disponibile, condotto da Rodrigo et al. (Biology of Reproduction, 2019) su 2008 campioni spermatici, ha documentato un tasso complessivo di FISH alterata del 14,6% (294/2008). Uno studio multicentrico spagnolo su 439 maschi infertili (Sarrate et al., 2019) ha riscontrato un tasso di alterazione ancora più elevato, pari al 26,7%(117/439).
Un dato clinicamente fondamentale: non esiste ancora uno standard universalmente accettato per definire i cut-off di normalità. Molti laboratori utilizzano come soglia di alterazione un valore superiore a 2 deviazioni standard rispetto alla media dei propri controlli normozoospermici. Lo studio di Luddi et al. (2024) sottolinea l’urgente necessità di aggiornare i range di normalità, anche alla luce del declino globale della qualità seminale osservato negli ultimi decenni.
Indicazioni cliniche
La FISH spermatica trova indicazione in un ampio spettro di condizioni cliniche. Ecco le principali, documentate dalla letteratura:
Aborto ricorrente
Questo è forse il contesto clinico più rilevante. Lo studio di Ramasamy et al. (2015) su 140 uomini con storia di aborto ricorrente ha dimostrato che il 40% degli uomini con densità e motilità spermatica normali presentava un aumento significativo delle aneuploidie spermatiche sia dei cromosomi sessuali che degli autosomi rispetto ai controlli. Questo dato è straordinariamente importante: significa che lo spermiogramma normale non esclude affatto un difetto meiotico responsabile degli aborti.
Fallimento ripetuto di IVF/ICSI
Le aneuploidie spermatiche rappresentano una causa sottovalutata di fallimento della fecondazione assistita. Nello studio di Rodrigo et al. (2019), i maschi con FISH alterata sottoposti a IVF/ICSI senza PGT-A mostravano risultati drammaticamente peggiori: tasso di gravidanza clinica per transfer del 18,1% vs. 36,3% nei casi con FISH normale, tasso di aborto del 62,5% vs. 34,9%, e tasso di nati vivi per ciclo di appena 4,9% vs. 19,6%.
Parametri seminali gravemente alterati
La concentrazione spermatica è il parametro seminale più fortemente associato ai risultati della FISH. Secondo Rodrigo et al., si osserva un incremento graduale della percentuale di FISH alterata al diminuire della concentrazione: dal 31,4% nei soggetti con meno di 1 milione di spermatozoi/mL a valori progressivamente più bassi man mano che la concentrazione aumenta. Lo studio di Sarrate et al. (2019) conferma che le categorie seminali più colpite sono:
- Fattore maschile severo (oligoastenoteratozoospermia grave): 76,5% di FISH alterata
- Oligoteratozoospermia: 64,3%
- Astenoteratozoospermia: 50,0%
- Teratozoospermia isolata: 46,7%
La teratozoospermia è risultata il parametro più predittivo di alterazione FISH nella regressione logistica multivariata. Condizioni morfologiche particolarmente gravi — come l’agenesia del flagello, la spermatozoi a doppia testa, la globozoospermia (sindrome della testa rotonda) e la necrozoospermia — sono associate a tassi particolarmente elevati di aneuploidia.
Un dato chiave: i normozoospermici non sono esenti
Circa il 19,8% dei soggetti normozoospermici nello studio di Sarrate et al. e fino al 10% in quello di Rodrigo et al. presentava un’alterazione della FISH. Questo conferma che i parametri seminali da soli non consentono di identificare una quota sostanziale di maschi infertili a rischio di aneuploidie spermatiche.
Anomalie cromosomiche strutturali del cariotipo
La FISH è essenziale come complemento al cariotipo convenzionale in diverse situazioni:
- Traslocazioni Robertsoniane: i portatori producono tra il 72,2% e il 92,8% di spermatozoi normali/bilanciati, ma una quota significativa è sbilanciata
- Traslocazioni reciproche: la variabilità è molto maggiore, con una proporzione di spermatozoi sbilanciati che oscilla tra il 29,4% e il 70,2%
- Inversioni pericentriche: 55,9-99,3% di spermatozoi normali/bilanciati
Sindrome di Klinefelter
La sindrome di Klinefelter (47,XXY) è la causa genetica più frequente di infertilità maschile (4-6% dei maschi infertili, fino all’11% degli azoospermici). La FISH sui linfociti periferici è fondamentale per identificare i mosaicismi (47,XXY/46,XY), presenti nel 10-15% dei casi, che possono sfuggire al cariotipo tradizionale con bandeggio G quando rappresentano meno del 10% delle cellule. I pazienti con mosaicismo hanno una prognosi migliore per il recupero di spermatozoi testicolari (micro-TESE), ma sia gli spermatozoi eiaculati che quelli testicolari dei soggetti Klinefelter mostrano un rischio aumentato di aneuploidia.
Maschio XX fenotipico
La FISH viene routinariamente utilizzata per determinare la presenza della regione SRY (sex-determining region) nei maschi fenotipici con cariotipo 46,XX
Microdelezioni del cromosoma Y
Le microdelezioni, i riarrangiamenti, le duplicazioni e le inversioni del cromosoma Y possono essere meglio caratterizzate dalla FISH in combinazione con il cariotipo e la PCR multiplex.
Monitoraggio post-trattamento gonadotossico
La FISH ha un ruolo importante nella valutazione dei pazienti dopo chemioterapia o radioterapia. I dati mostrano che:
- Dopo chemioterapia BEP per tumore testicolare, l’aneuploidia spermatica aumenta e torna ai livelli basali tipicamente entro 2 anni
- Dopo ABVD/NOVP per linfoma di Hodgkin, il ritorno alla normalità avviene in mesi
- Anche farmaci come il finasteride possono indurre un aumento della diploidia e della disomia dei cromosomi sessuali, che persiste fino a 1 anno dopo la sospensione
- Esposizioni professionali a organofosforici e acrilonitrile sono associate a incrementi della disomia spermatica
Età paterna avanzata
L’età paterna avanzata è un’indicazione emergente, con evidenze di un incremento delle anomalie cromosomiche spermatiche nel gruppo 40-49 anni.
Impatto sugli outcome riproduttivi e ruolo del PGT-A
La dimostrazione più convincente dell’utilità clinica della FISH spermatica viene dalla correlazione con gli esiti della PMA. Lo studio di Rodrigo et al. (2019), basato su 18 anni di esperienza clinica, fornisce dati molto eloquenti:
Senza PGT-A: la FISH alterata è devastante
Nei cicli IVF/ICSI senza screening preimpianto, la FISH spermatica alterata si associava a:
- Tasso di gravidanza clinica: 18,1% vs. 36,3% (p<0,0001)
- Tasso di impianto: 8,9% vs. 22,8% (p<0,0001)
- Tasso di aborto: 62,5% vs. 34,9% (p<0,0001)
- Tasso di nati vivi per ciclo: 4,9% vs. 19,6% (p<0,0001)
Con PGT-A: la FISH alterata si “corregge”
Quando veniva applicato il PGT-A (test genetico preimpianto per aneuploidie), i risultati nei casi con FISH alterata miglioravano drasticamente:
- Tasso di gravidanza clinica: 44,0% (vs. 18,1% senza PGT-A)
- Tasso di impianto: 36,2% (vs. 8,9%)
- Tasso di aborto: 18,4% (vs. 62,5%)
- Tasso di nati vivi: 26,4% (vs. 4,9%)
Questo dato ha un’implicazione clinica diretta: i pazienti con FISH alterata beneficiano enormemente della selezione embrionale mediante PGT-A.
Consulenza genetica
E’ importante la consulenza genetica per le coppie con FISH spermatica alterata. I punti chiave della consulenza includono:
- Informare sul rischio di trisomie e aneuploidie dei cromosomi sessuali nella prole
- Discutere le opzioni riproduttive: PGT-A con IVF/ICSI, diagnosi prenatale (villocentesi/amniocentesi), donazione di sperma, adozione
- Discutere il potenziale beneficio della selezione spermatica avanzata
Limiti della tecnica e prospettive future
La FISH spermatica, pur essendo uno strumento di grande valore, presenta alcune limitazioni riconosciute:
- Analisi limitata: vengono valutati solo i cromosomi per i quali si utilizzano sonde specifiche (tipicamente 5), non l’intero complemento cromosomico
- Incapacità di rilevare anomalie strutturali: la FISH identifica solo alterazioni numeriche, non traslocazioni o inversioni negli spermatozoi stessi
- Costo elevato:
- Analisi laboriosa: il conteggio manuale richiede 5-10 ore, sebbene i sistemi automatizzati (Metafer Metasystems) stiano migliorando il throughput
- Assenza di standard universali per definire i cut-off di normalità
Il Next-Generation Sequencing (NGS) rappresenta una frontiera promettente per un’analisi più completa del genoma spermatico, offrendo potenzialmente la valutazione simultanea di tutti i cromosomi. Tuttavia, al momento la FISH resta il metodo di riferimento clinico per lo screening delle aneuploidie spermatiche, grazie alla sua validazione clinica consolidata e alla relativa semplicità operativa.
Sintesi pratica per la pratica clinica
La FISH spermatica dovrebbe essere considerata come esame di secondo livello nello studio dell’infertilità maschile, particolarmente raccomandata nei seguenti scenari:
- Aborti ricorrenti (anche con spermiogramma normale)
- Fallimenti ripetuti di IVF/ICSI
- Oligozoospermia severa, teratozoospermia, OAT
- Portatori di anomalie cromosomiche strutturali (traslocazioni, inversioni)
- Sindrome di Klinefelter (anche sospetto mosaicismo)
- Età paterna avanzata
- Post-chemioterapia/radioterapia
- Infertilità maschile idiopatica
Il risultato della FISH non è fine a sé stesso: orienta la strategia terapeutica (PGT-A vs. IVF/ICSI standard), guida la consulenza genetica e consente alla coppia di effettuare scelte riproduttive informate.
