Analisi Genetica Preimpianto Non Invasiva (niPGT)

Premessa e contesto storico

L’analisi genetica preimpianto (PGT, Preimplantation Genetic Testing) rappresenta da oltre due decenni uno strumento fondamentale nella medicina della riproduzione assistita. Il principio è noto: identificare anomalie cromosomiche o genetiche negli embrioni ottenuti tramite fecondazione in vitro (FIVET/ICSI) prima del loro trasferimento in utero, migliorando i tassi di impianto, riducendo gli aborti e aumentando le probabilità di un nato sano. La procedura convenzionale prevede la biopsia del trofectoderma (TE) allo stadio di blastocisti (giorno 5-6 di coltura), con prelievo di 5-10 cellule dalla porzione destinata a formare la placenta, seguite da analisi tramite NGS (Next-Generation Sequencing) o aCGH.

Tuttavia, questa procedura invasiva comporta limiti intrinseci: richiede un embriologo altamente specializzato, può potenzialmente danneggiare l’embrione, e soprattutto fornisce informazioni genetiche limitate alle sole cellule del trofectoderma, che non necessariamente riflettono lo stato genetico della massa cellulare interna (ICM), ovvero quella porzione che darà origine al feto. Proprio da queste criticità nasce l’esigenza di una metodica non invasiva.

Nel 2013, una scoperta ha cambiato le prospettive: la dimostrazione che gli embrioni rilasciano DNA libero (cell-free DNA, cfDNA) nel terreno di coltura durante il loro sviluppo in vitro, in modo analogo a quanto avviene per il cfDNA fetale nel plasma materno, principio su cui si fonda il NIPT (Non-Invasive Prenatal Testing, il test prenatale non invasivo). Da quella intuizione si è sviluppata la niPGT: la possibilità di analizzare il corredo cromosomico e genetico dell’embrione senza toccarlo, semplicemente raccogliendo e sequenziando il DNA presente nel terreno di coltura esaurito (spent culture medium, SCM).

Principi biologici: da dove viene il cfDNA embrionale

Comprendere l’origine del cfDNA nel terreno di coltura è fondamentale per interpretare correttamente i risultati e i limiti della niPGT. Secondo la review pubblicata su Medicine nel 2024 da Yang et al., il cfDNA nel SCM ha origini molteplici e ancora non completamente chiarite:

• Apoptosi e necrosi cellulare: durante lo sviluppo embrionale, cellule danneggiate o difettose vanno incontro a morte programmata (apoptosi) o non programmata (necrosi), rilasciando frammenti di DNA nel mezzo circostante. 
• Rilascio attivo tramite vescicole extracellulari: la blastocisti, durante la sua crescita, secerne attivamente DNA attraverso microvescicole ed esosomi. Questo meccanismo potrebbe rappresentare una forma di comunicazione embrione-ambiente, un segnale biologico ancora in parte misterioso.
• Auto-correzione embrionale: una delle ipotesi più affascinanti è che l’embrione “elimini” attivamente cellule aneuploidi, espellendole verso il trofectoderma e rilasciando il loro contenuto genetico nel mezzo. Questo meccanismo di self-correction spiegherebbe perché embrioni classificati come “a mosaico” alla biopsia TE possano poi dare origine a gravidanze e nati sani.

La concentrazione del cfDNA nel SCM tende ad aumentare progressivamente con il tempo di coltura, risultando significativamente più elevata al giorno 6 rispetto al giorno 5, con un incremento del tasso di informatività dal 69.4% al 97.9%. Questo dato ha importanti implicazioni pratiche sulla tempistica di raccolta del campione.

La procedura tecnica della niPGT

Raccolta del campione

Il protocollo niPGT, nella sua versione più standardizzata, prevede i seguenti passaggi:

1. Coltura embrionale standard fino al giorno 3-4 post-fecondazione.
2. Lavaggio dell’embrione al giorno 4: passaggi multipli in gocce di terreno fresco per rimuovere residui di cellule del cumulo e altri contaminanti materni.
3. Trasferimento in coltura individuale: ciascun embrione viene collocato in una goccia singola di 10 μL di terreno fresco, DNasi-free e RNasi-free.
4. Coltura proseguita fino al giorno 6 (o giorno 7): la blastocisti rilascia cfDNA nel terreno durante la sua espansione.
5. Raccolta del terreno esaurito (SCM): al momento della biopsia TE (se eseguita in parallelo) o della vitrificazione, il terreno viene aspirato con micropipetta sterile monouso, trasferito in provette PCR sterili e conservato a -80°C.
6. Amplificazione del DNA: il cfDNA, presente in quantità estremamente basse (circa 20-22 ng/μL), viene amplificato mediante tecniche di Whole Genome Amplification (WGA).
7. Sequenziamento NGS: il DNA amplificato viene sottoposto a Next-Generation Sequencing per l’analisi delle variazioni del numero di copie (CNV) lungo tutti i cromosomi.

Tipologie di niPGT

Analogamente al PGT convenzionale, la niPGT si declina in tre categorie principali:

• niPGT-A (per Aneuploidie): la forma più studiata e avanzata. Mira a identificare anomalie cromosomiche numeriche (trisomie, monosomie) per selezionare embrioni euploidi.
• niPGT-M (per Malattie Monogeniche): screening per disordini ereditari a singolo gene come fibrosi cistica, beta-talassemia, malattia di Tay-Sachs. 
• niPGT-SR (per Riarrangiamenti Strutturali): identificazione di traslocazioni, inversioni e altri riarrangiamenti strutturali cromosomici.

Il problema della contaminazione materna

Questo è probabilmente l’ostacolo tecnico più rilevante per la niPGT. Come documentato da eBioMedicine (2025), il cfDNA nel terreno di coltura non è esclusivamente di origine embrionale. Lo studio di Chen et al. (2021) ha dimostrato che nel SCM:

• 33% del cfDNA proviene dall’embrione
• 12% dalle cellule della granulosa
• 4% dai corpi polari
• Il restante da contaminazione esogena (albumina sierica umana nel terreno, DNA ambientale)

In circa due terzi dei campioni SCM, la contaminazione materna supera il 20%, con conseguenze dirette:

• Falsi negativi: embrioni aneuploidi classificati come euploidi perché il DNA materno “diluisce” il segnale aneuploide
• Discordanze sessuali: un embrione maschile può apparire femminile se il DNA materno è predominante

Strategie per ridurre la contaminazione

Diverse soluzioni sono state proposte:

1. Lavaggi embrionali al giorno 3-4: passaggi sequenziali in terreno fresco per rimuovere cellule del cumulo residue.
2. Denudazione al giorno 0 e giorno 3: doppia rimozione delle cellule della granulosa migliora il rapporto maschi/femmine nei campioni.
3. Uso esclusivo di ICSI: evita la contaminazione spermatica legata alla zona pellucida, caratteristica dell’IVF convenzionale.
4. Terreni di coltura DNA-free: formulazioni prive di albumina sierica umana o con albumina ricombinante.
   Il mosaicismo: sfida condivisa tra PGT e niPGT

Il mosaicismo embrionale — la coesistenza di cellule euploidi e aneuploidi all’interno dello stesso embrione — rappresenta una sfida trasversale per ogni forma di analisi genetica preimpianto. La biopsia TE campiona solo 5-10 cellule del trofectoderma, che potrebbero non essere rappresentative dell’ICM.

Un dato particolarmente interessante è che la niPGT-A potrebbe essere più accurata nel diagnosticare il mosaicismo rispetto alla biopsia TE. Come riportato da Cao et al. (2021), il cfDNA nel SCM ha mostrato una concordanza del 100% con l’analisi dell’intera blastocisti (WB) per embrioni a mosaico, suggerendo che il cfDNA, derivando dall’intero embrione (sia trofectoderma che ICM), offre una fotografia più completa dello stato cromosomico complessivo.

Il trial clinico cinese multicentrico in doppio cieco

Un passaggio cruciale per l’adozione clinica della niPGT è la validazione attraverso trial randomizzati controllati (RCT). Il protocollo pubblicato su BMJ Open nel 2022 descrive un RCT multicentrico cinese in doppio cieco con 1148 coppie, che confronta la selezione embrionale basata su morfologia + niPGT-A versus morfologia da sola, con outcome primario il tasso di nato vivo per primo trasferimento. I risultati definitivi di questo trial saranno fondamentali per stabilire se la niPGT-A offra un reale vantaggio clinico.

Un ulteriore RCT è in corso per confrontare direttamente le due strategie, con l’ipotesi che la selezione basata su morfologia + niPGT-A determini un tasso di nati vivi superiore e un tasso di aborto inferiore.

Applicazioni cliniche attuali: screening o diagnostica?

Un punto fermo della comunità scientifica, ribadito da Rubio nel programma EMBRACE, è che la niPGT-A, allo stato attuale, non viene proposta come test diagnostico ma come biomarker per la prioritizzazione embrionale. In altri termini: non si tratta di sostituire la biopsia TE, ma di fornire un criterio aggiuntivo — e non invasivo — per decidere l’ordine di trasferimento degli embrioni.

Le applicazioni cliniche più promettenti includono:

1. Pazienti che rifiutano la biopsia embrionale: per ragioni etiche, religiose o personali.
2. Rescue di cicli PGT-A con risultato non informativo: la strategia di rescue EMBRACE prevede lo scongelamento della blastocisti, ri-coltura per 8 ore e ri-analisi del nuovo SCM, con tasso di recupero dell’85.7%.
3. Backup alla biopsia TE: come proposto da Chen et al. (2025), la niPGT-A dal SCM può servire come conferma complementare quando i risultati TE sono dubbi.
4. Prioritizzazione embrionale in pazienti giovani: come suggerito da Sakkas all’ASRM 2024, la niPGT-A potrebbe rappresentare un primo livello di screening per pazienti giovani, riservando la biopsia invasiva alle pazienti di età avanzata.
5. Centri senza embriologo specializzato in biopsia: la niPGT elimina la necessità della biopsia TE, procedura tecnicamente complessa, rendendo lo screening genetico accessibile a un numero maggiore di centri PMA.

Limiti e controversie

Per onestà intellettuale, è doveroso riassumere le principali criticità:

1. Specificità insufficiente: il dato del 50.7% riportato dallo studio Nature 2025 significa che circa metà degli embrioni euploidi verrebbe erroneamente classificata come aneuploide, con il rischio concreto di scartare embrioni vitali.
2. Contaminazione materna: in circa 2/3 dei campioni SCM la contaminazione supera il 20%, con DNA proveniente da cellule della granulosa, corpi polari e terreno di coltura. 
3. Variabilità dei risultati tra studi: la concordanza con biopsia TE varia enormemente, dal 30% al 95%, in funzione di protocollo, timing, metodo di amplificazione e piattaforma di sequenziamento.
4. Assenza di protocolli standardizzati: non esiste ancora una SOP (Standard Operating Procedure) universalmente accettata per volume della goccia, timing di raccolta, metodo WGA, piattaforma NGS e soglie di classificazione.
5. Fallimenti di amplificazione: il tasso di campioni non informativi può raggiungere il 30-40%, soprattutto se la raccolta avviene al giorno 5.
6. Assenza di RCT conclusi: i trial randomizzati sono in corso ma non ancora pubblicati; mancano prove definitive di un beneficio clinico in termini di tasso di nati vivi.

Considerazioni per la pratica clinica attuale

Ad oggi, la posizione più equilibrata — condivisa dalla maggioranza degli esperti — è che la niPGT-A debba essere considerata:

• Non un sostituto della biopsia TE per la diagnostica genetica preimpianto
• Un potenziale strumento complementare di screening e prioritizzazione embrionale
• Una strategia di rescue per embrioni con risultato PGT-A non informativo
• Un’opzione per pazienti che rifiutano la biopsia invasiva
• Una tecnologia in rapida evoluzione che, con il perfezionamento dei protocolli di raccolta, amplificazione e decontaminazione computazionale, potrebbe nei prossimi anni raggiungere un’affidabilità clinica sufficiente per un uso più diffuso

Conclusioni

La niPGT rappresenta una delle frontiere più promettenti e al contempo più dibattute della medicina della riproduzione. Il concetto di ottenere informazioni genetiche complete dall’embrione senza nemmeno sfiorarlo ha un fascino scientifico ed etico evidente. I dati accumulati negli ultimi 10 anni dimostrano che il cfDNA nel terreno di coltura contiene effettivamente informazioni cromosomiche significative, con una sensibilità che raggiunge l’84-92% .

Tuttavia, la strada verso l’implementazione clinica routinaria richiede ancora: la risoluzione del problema della contaminazione materna, la standardizzazione dei protocolli di laboratorio, il miglioramento della specificità, e soprattutto la validazione tramite trial randomizzati controllati su larga scala. I risultati dei RCT multicentrci in corso saranno dirimenti.

Nel frattempo, per un centro di PMA che voglia posizionarsi all’avanguardia, la niPGT-A può essere ragionevolmente offerta come strumento di screening complementare, particolarmente nella strategia EMBRACE per la prioritizzazione embrionale, nell’ottica di una medicina riproduttiva sempre più personalizzata e meno invasiva.